在前面，我们陆续介绍过一些有关流式的荧光定量问题。下面再作一些阐述。

在介绍之前，我们来熟悉几个词：MESF，ABC， F:P。

MESF：英文名是Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome （等效可溶性荧光染料分子），它是用来量化荧光强度的单位，是通过将微球标准品的荧光强度信号与相同荧光染料溶液的信号进行比较来确定的。MESF并不真实代表着微球上有多少个荧光染料分子，只是表示微球的荧光强度等效于溶液中多少个荧光分子的强度。

ABC：英文名是 Antibody/Antigen binding Capacity (抗体/抗原结合能力），它是指微球表面结合抗体或抗原的能力，也就是能接多少个抗体/抗原。

F:P:  英文名是efective fluorescence to protein (F/P) ratio , 它是指有效荧光与蛋白的(比值F/P), 简单一点说，就是每个抗体(抗原）的MESF值。

由上，我们可以很容易得出以下公式：

F:P=MESF/ABC

知道了任意两个参数，就可以推算出第三个参数，我们一般需要的是ABC的值，因此我们得先知道MESF和F:P。下面讲如何使用Bangslabs的荧光定量微球来定量细胞表面的抗体/抗原表达量。

Bangslabs 提供两类荧光定量的微球：Quantum™ MESF 和 Quantum™ Simply Cellular® 。前者包括一组空白球，以及四组不同MESF的荧光球（FITC有五组），通过流式的分析结合软件（Banglabs提供的计算表格，可免费索取），我们可以得到MESF的标准曲线。用户可以用同种荧光标记的一抗与细胞孵育后，上流式，也得到一个荧光值，然后再从标准曲线上找到对应的MESF值，用MESF来对表达量进行相对定量。显然，我们更希望是得到一个ABC值，对表达量进行一个绝对的定量，根据上面的公式，我们还需要一个F:P值。此时，你就需要Quantum™ Simply Cellular®（QSC）了。

QSC kit 是五组分配不同ABC值的微球，它的原理很简单，就是在微球的表面偶联了不同数量的二抗，当用荧光一抗与二抗孵育时，一抗与二抗的结合，就好像抗体与抗原结合一样。我们用过量的荧光一抗与上述五组微球孵育后，通过软件，输入读得的荧光强度后，可以得到一个ABC--MESF的标准曲线。再用同样的荧光一抗与自己的分析细胞孵育后，上流式，通过得到的荧光值，就可以在标准曲线上找到对应的ABC值。

显然用QSC 是可以直接通过计算软件得到ABC与MESF值的，也就是说F:P可以算出来。用户如果用了Quantum™ MESF kit， 再用QSC算出F:P，求ABC也是可以的，但是这是很浪费，因为我们可以用QSC直接就得到ABC。但为什么厂家还会出Quantum™ MESF kit，这是因为求F:P，我们只需要QSC试剂盒中的单组就可以了，不需要买一个全试剂盒！这类单组的试剂货号是#810、812 和#813。

如果您的抗体很贵，就可以用Qantum™ MESF kit 加单组QSC得到ABC。当然如果你的抗体充足，可以直接买Quantum™ Simply Cellular®。更简单的就是用MESF值评估表达量。

其实F:P的值，还有两种方法可以获得：一是向荧光抗体的厂家索要，这适合商品化的抗体；二是自制的荧光抗体，可以用Nanodrop和荧光计自己确认。

在此申明的是，无论哪种试剂盒，最后得到的依然是一个相对的定量。就算是QSC的结果也是如此，因为细胞与微球，二抗与抗原毕竟还是有差别，我们能做的只是尽可能的去接近表达的真相。为了数据的可靠性，我们所能做的是尽一切可能将细胞与微球置于同一条件下进行分析，对步骤进行标准化。

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