背景： 本 ELISA 检测利用竞争性结合原理来测量植物提取物中的激素浓度。IAA-吲哚-3-乙酸 (C1') 激素特异性抗体预包被于反应孔表面。将含有未知量激素的植物提取物样品与已知量的示踪剂混合在反应孔中，并与反应孔中有限数量的抗体发生反应。在孵育过程中，样品中的激素与示踪剂竞争抗体结合位点。未结合的激素、示踪剂和植物提取物被从反应孔中洗脱出来。加入底物后，底物与结合于抗体的示踪剂发生反应，生成黄色产物。通过同时处理标准品和样品，绘制标准曲线，将样品的吸光度转化为激素浓度。
反应孔：抗体包被并封闭，5 个用于 480 次测定，60 条带，8 个孔
示踪剂： 20-50 µl
示踪稀释剂： 5x 250 mM TBS Tris、10 mM NaCl、1 mM MgCl2、pH 7.5 储备液 + 0.02% NaN3
反应及洗涤液： 10x TBS 原液+0.02% NaN3
终止试剂： 2x 5 N KOH 溶液
底物稀释剂： 10x 500 mM NaHCO3 原液，pH 9.6+0 0.02 %.0 0.02 % NaN 3
底物： 100毫克
标准品： 各 600 µl：15.6 pmol、7.8 pmol、3.9 pmol、1.95 pmol、975 fmol、488 fmol、244 fmol、122 fmol、61 fmol、30.5 fmol、15.2 fmol
检测开发时间： 4-5小时
灵敏度： 0.01 至 10 pmol/50 µl
植物提取物体积： 50 µl（用于藻类 - 请咨询）
与粪臭素的交叉反应率为 3.3%；该抗体也会结合 IAA 葡萄糖酯。
检测参数
非特异性结合： 2.5%
中量（B/Bo=50%）： 0.02-10 pmol
检测限| 12.25 pg (7 fmol)
测量线性范围： 15-500 fmol
测定内变异性： 3.6%
测定间变异性： 4.3%
每次测定的示踪剂量： 10 ng
结构相关的生长素和相关化合物与抗 IAA C1 抗体的交叉反应
样品清理：
植物提取物在 ELISA 分析前所需的处理可能因植物而异，并取决于实际的研究目标。在大多数情况下，需要先用 C18 反相色谱法去除色素和亲脂性物质，然后再用 DEAE-纤维素-反相 C18 组合柱去除。为此， 可以使用 Waters Sep-Pack C18 或任何其他 C18 吸附剂（例如 Millipore 等）并获得满意的结果。在进行 ELISA 分析之前，必须用重氮甲烷对 IAA 样品进行甲基化，例如使用市售试剂 2.0 M三甲基硅基重氮甲烷（溶于己烷）（Sigma）或更安全的替代品 TMSD（三甲基硅基重氮甲烷）。
藻类、蓝藻和苔藓无需进行样品纯化。
从植物组织中提取和纯化IAA的示例：
将冷冻的植物组织在液氮下研磨成细粉。将粉末在含有二乙基二硫代氨基甲酸钠（400 ug . g-1 FW）的冰冷70%乙醇（10 ml . g-1 FW）中提取。将约420 Bq（25.000 dpm）的[2- 3 H]生长素示踪剂添加到提取物中，以监测纯化步骤中的损失并验证色谱数据。提取2小时后，将匀浆离心（15 000 g，4°C），并以相同方式重新提取沉淀物。然后将合并的提取物通过反相C18柱纯化，以消除叶绿素和脂质。随后在35°C下通过真空旋转蒸发将提取物浓缩至约1.0 ml。样品用含有二乙基二硫代氨基甲酸钠的醋酸铵缓冲液（40 mM，pH 6.5）稀释至20 ml。对于免疫测定稀释分析，将2 ml洗脱液真空干燥，并重新溶解于Tris缓冲液（TBS，50 mM Tris，10 mM NaCl，1 mM MgCl 2，pH 7.5）中。这些溶液的等分试样可以进行连续稀释分析，也可以与已知量的IAA标准品混合，然后通过ELISA进行分析。提取物进一步使用二乙氨基乙基纤维素（1.0 x 5.0 cm）-十八烷基硅胶（0.5 x 1.5 cm）组合柱纯化。将IAA及其氨基酸代谢物上样到DEAE柱芯上，然后用10 ml蒸馏水洗涤，并用5 ml 6% HCOOH（v/v）洗脱。将洗脱液上样至C18柱，用5 ml蒸馏水洗涤后，再用5 ml甲醇洗脱。然后将洗脱液蒸发至干，溶于50 ul 70%乙醇+250 ul蒸馏水中，并通过HPLC预过滤器（0.22 um）过滤。在进行ELISA分析之前，必须用重氮甲烷对样品进行甲基化，例如使用市售试剂2.0 M（三甲基硅基）重氮甲烷的己烷溶液（Sigma）。
建议的甲基化方案：将2.0 M（三甲基硅基）重氮甲烷的己烷溶液（Sigma）（比例：40 µl ml-1）加入到IAA标准品和收集的样品中。轻轻混合样品，在室温下静置30分钟，试管口略微打开。孵育后，向每管中加入 5 µl 0.05 N 乙酸，室温下再孵育 30 分钟。将塑料管置于室温避光或缓慢氮气流下过夜，直至甲醇溶液完全蒸发。
甲基化是检测游离 IAA 及其结合物的必要步骤。
