东莞汉诺生物提供Agrisera反式玉米素核苷ELISA Kit

产品描述

背景：本 ELISA 检测利用竞争性结合原理来测量植物提取物中的激素浓度。反式玉米素核糖特异性抗体预包被于反应孔表面。将含有未知量激素的植物提取物样品与已知量的示踪剂混合在反应孔中，并与反应孔中有限数量的抗体发生反应。在孵育过程中，样品中的激素与示踪剂竞争抗体结合位点。未结合的激素、示踪剂和植物提取物被从反应孔中洗脱出来。加入底物后，底物与结合于抗体的示踪剂发生反应，生成黄色产物。通过同时处理标准品和样品，绘制标准曲线，将样品的吸光度转化为激素浓度。

反应孔：抗体包被并封闭，5 个用于 480 次测定，60 条带，8 个孔

示踪剂： 20-50 µl

示踪稀释剂： 5x250 mM TBS Tris、10 mM NaCl、1 mM MgCl2、pH 7.5 储备液 + 0.02% _NaN3

反应及洗涤液： 10x TBS 原液+0.02% _NaN3

终止试剂： 2x 5 N KOH 溶液

底物稀释液： 10x 500 mM NaHCO ₃原液，pH 9.6+0 0.02 %.0 0.02 % NaN ₃

底物： 100毫克

标准：各 600 µl；15.6 pmol、7.8 pmol、3.9 pmol、1.95 pmol、975 fmol、488 fmol、244 fmol、122 fmol、61 fmol、30.5 fmol、15.2 fmol

检测开发时间： 4-5小时

灵敏度： 0.01 至 10 pmol/50 µl

植物提取物体积： 50 µl

重要提示：请勿甲基化细胞分裂素样本，因为这将显著降低检测的灵敏度。

检测参数

非特异性结合： 2.5%

中量（B/Bo=50%）： 0.02-10 pmol

检测限： 12.25 pg（7 fmol）

测量线性范围： 15-500 fmol

测定内变异性： 3.6%

测定间变异性： 4.3%

每次测定的示踪剂量： 10 ng

样品净化：
ELISA分析前所需的植物提取物处理可能因植物而异，并取决于实际研究目标。大多数情况下，色素和亲脂性物质需要先通过C18反相色谱柱去除，然后再使用DEAE-纤维素-反相C18组合柱进行分离。

可以直接分析藻类和细菌样本，或者在预净化后进行分析。

植物组织提取和纯化示例：
将冷冻的植物组织在液氮下研磨成细粉。将粉末在含有二乙基二硫代氨基甲酸钠（400 ug . g-1 FW）的冰冷70%乙醇（10 ml . g-1 FW）中提取。将约420 Bq（25.000 dpm）的[2- ³ H]生长素示踪剂添加到提取物中，以监测纯化步骤中的损失并验证色谱数据。提取2小时后，将匀浆离心（15 000 g，4°C），并以相同方式重新提取沉淀物。然后将合并的提取物通过反相C18柱纯化，以去除叶绿素和脂质。随后，在35°C下通过真空旋转蒸发将提取物浓缩至约1.0 ml。样品用含有二乙基二硫代氨基甲酸钠的醋酸铵缓冲液（40 mM，pH 6.5）稀释至20 ml。对于免疫测定稀释分析，将2 ml洗脱液真空干燥，并重新溶解于Tris缓冲液（TBS，50 mM Tris，10 mM NaCl，1 mM MgCl ₂，pH 7.5）中。这些溶液的等分试样可以进行连续稀释分析，也可以与已知量的IAA标准品混合，然后通过ELISA进行分析。提取物进一步使用二乙氨基乙基纤维素（1.0 x 5.0 cm）-十八烷基硅胶（0.5 x 1.5 cm）组合柱纯化。将IAA及其氨基酸代谢物上样到DEAE柱芯上，然后用10 ml蒸馏水洗涤，并用5 ml 6% HCOOH（v/v）洗脱。将洗脱液上样至C18柱，用5毫升蒸馏水洗涤后，再用5毫升甲醇洗脱。洗脱液蒸发至干，溶于50微升70%乙醇+250微升蒸馏水中，经HPLC预滤器（0.22微米）过滤。在进行ELISA分析前，IAA样品必须用重氮甲烷进行甲基化。