微环境下的pH 探针

2025-09-05

有时候，我们需要了解微环境下（如组织内、细胞内、液泡内/溶酶体）的pH条件对某些生命活动的影响。如细胞内pH是如何影响转染核酸的命运，酶的活性是如何受pH调控的等。此时，一款表现优异的pH指示剂（探针）就显得尤为重要。

FITC 的荧光（以及吸光度）高度依赖于 pH 值，可以用来作为pH指标剂。也就是先在不同已知pH的标准缓冲液中测量FITC荧光强度，建立一条“荧光强度-pH”的标准曲线。然后测量样本的荧光强度，代入标准曲线反推出pH值。这也就是我们常说的单荧光法。从原理来看，我们假设的是FITC的荧光强度只与pH值相关，事实上并不是这样。荧光的强度还受FITC的浓度、光路和检测的稳定性、背景荧光、以及荧光的漂白程度的影响。比如说FITC荧光强度上升了，可能不是环境中的pH上升引起，而是环境中FITC浓度增加导致的。

为了解决这个问题，引入了双荧光比值法。

双荧光比值探针通常有两个荧光染料：一个对pH敏感（如FITC），另一个对pH不敏感（如TRITC）。下面具体讲如何解决问题的：

校正探针浓度差异：

机制：对pH不敏感的荧光信号作为内部参考（Internal Reference）。它的强度只与探针的浓度和分布有关。

效果：当你计算比值（pH敏感信号的强度 / pH不敏感信号的强度）时，分子和分母都同时包含了探针浓度的信息。这个比值抵消了探针浓度的影响。无论一个细胞加载的探针是多是少，只要pH相同，它们的比值就是相同的。

校正光路和检测器的波动：

机制：光源波动或检测器灵敏度变化会同等地影响两个波长的信号。如果光强减弱10%，两个信号的强度都会减弱10%。

效果：在计算比值时，这个系统性的误差同样会被抵消掉。比值保持不变，只反映pH的变化。

校正光漂白和探针泄漏：

机制：探针的泄漏和光漂白通常对两个波长的影响是成比例的。

效果：同样，比值计算可以最大限度地减少这些因素的影响，使实验结果更加稳定可靠。

提供内置的校准：

机制：通过使用高pH（碱性）和低pH（酸性）缓冲液对细胞进行滴定，可以建立一条比值-pH标准曲线。

效果：此后，在任何实验中测得的荧光比值，都可以通过这条标准曲线直接换算成绝对的pH值，而单荧光法很难进行这种精确的绝对定量。

现在我们所需要的是为这两种荧光找到一个载体，能输送到微环境中去。这种物质首先能标记两种荧光，而且两种荧光的标记比值稳定；其次，要对生物体无害，而且不易被代谢。葡聚糖能很好地满足以上要求。

TDB LABS 提供两种这样的探针：FITC-TRITC-葡聚糖500和FITC-Antonia Red-葡聚糖 20，FITC 的荧光强度依赖于 pH 值，而 TRITC 和 AR 的荧光在 pH 值 2 至 10 之间几乎保持不变。这使得它们非常适合在 pH 值范围（3.5 至 8.0）内精确测定和监测活细胞或组织 pH 值的应用（见图1,2）。

图1. FITC-TRITC Dextran（FTD500）双荧光随pH变化的关系

图2. FITC-Antonia Red Dextran （FARD20）双荧光随pH变化的关系

我们再来看看两个产品的双荧光比值与pH关系的 Henderson-Hasselbalch 方程拟合情况。

图3. FARD与FTD产品的双荧光比值与pH关系

从上面可以看到，两个产品的工作跨度在pH3.5 至 8.0 之间，这已经覆盖了生命体的酸碱范围。Thermo fisher也有类似的产品: LysoSensor Yellow/Blue，其激发在紫外365nm，能量较高，可能对细胞等检测对象造成一定的伤害。

[1] Han, J. & Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem. Rev. 110, 2709–2728 (2010).

[2] Takahashi, S. et al. Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools To Measure pH Values in Living Samples. J. Am. Chem. Soc. 140, 5925–5933 (2018).

[3] Weigert, R. (Ed.) Advances in Intravital Microscopy From Basic to Clinical Research. Springer Science. ISBN 978-94-017-9360-5. DOI 10.1007/978-94-017-9361-2. Heidelberg (2014).

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